盐酸戊乙奎醚通过抑制自噬减轻肢体缺血再灌注诱发小肠自噬的实验研究

【摘要】研究背景Sewell在1955年结扎狗冠状动脉时,发现恢复血流后组织器官损伤加重。缺血再灌注损伤被首次发现,在之后的大量动物实验中已得到证实。肢体缺血再灌注损伤(Limbischemiareperfusioninjury-LIRI)不仅可导致局部组织损伤,还可引起远隔脏器损伤,小肠缺血再灌注损伤还会因为细菌和毒素的释放,诱发全身炎症反应综合征(SIRS),多器官功能障碍综合征(MODS)等。目前对小肠缺血再灌注损伤的研究大都与凋亡有关。以往认为坏死和凋亡是缺血再灌注所诱导的细胞死亡的主要方式。近年来,一种新的程序性细胞死亡方式——自噬(Autophagy),即Ⅱ型程序性细胞死亡,越来越受到重视。适度的自噬是细胞完成自身代谢和细胞器更新的重要方式,对维持机体内环境稳定,以及调控细胞损伤和老化具有重要意义；而非生理性的、过度的自噬则会导致细胞过多死亡,从而引起组织器官产生病理性变化。自噬甚至可能影响细胞凋亡的发生,自噬在小肠缺血再灌注损伤的不同阶段扮演着不同角色,缺血期自噬轻度增加,具有一定的保护作用；但是在再灌注期自噬明显增加,反而加重小肠损伤。种种迹象表明,再灌注后小肠细胞自噬异常增多可能是导致小肠结构和功能损伤的重要启动因素之一。如果能够早期、有效抑制自噬的发生,有望减轻小肠缺血再灌注损伤,甚至减少细胞凋亡的发生。盐酸戊乙奎醚注射液(长托宁)是我国自主研制的新型抗胆碱药,具有选择性M1、M3和N1、N2受体拮抗作用,对中枢和外周均有很强的抗胆碱作用,而对M2受体无明显作用,可有效避免阿托品因缺乏M受体亚型选择性所致的心动过速与阻断突触前膜M2受体调节功能,且药效长而副作用较少。前期的研究表明,长托宁可抑制由缺血再灌注损伤诱发的小肠细胞凋亡,但长托宁对小肠细胞自噬的影响研究文献报道较少。研究目的本实验以肢体缺血再灌注损伤大鼠小肠为实验研究和观察对象,建立肢体缺血再灌注模型,以长托宁进行干预,观察各组LDH释放量。从而评价各组小肠组织和细胞的受损程度；荧光染色、并通过RT-PCR和Western-blot方法检测小肠组织的自噬相关基因(autophagy-relatedgene,Atg)的mRNA和蛋白表达水平,从细胞和分子水平探讨长托宁对肢体缺血再灌注损伤中小肠细胞自噬的影响,为临床围手术期小肠保护提供新的理论基础和可能的治疗方法。研究方法和结果本实验主要分为二个部分,主要方法和结果如下：一.大鼠肢体缺血再灌注损伤诱发小肠自噬的研究1、实验分组：成年雄性SD大鼠48只,随机分为2组,假手术组(S组),缺血再灌注组(LIR组),S组、LIR组组内按再灌注时间分为再灌注0h(To)、2h(T2)、4h(T4),、8h(T8)4个亚组,每亚组6只。假手术组(S组)：成年SD大鼠,暴露股动脉后仅于股动脉表面穿过缝线,并不结扎股动脉,于相应时点取血及小肠组织,随即处死大鼠。缺血再灌注组(LIR组)：成年SD大鼠,分离暴露股动脉,动脉夹夹闭股动脉；再用市售橡皮筋(直径2.5cm)环扎大鼠双下肢近心端(压力290-310mmHg,1mmHg=0.133kpa)3,,再灌注0h、2h、4h、8h。于相应时点取血及小肠组织,并处死大鼠。2、大鼠肢体缺血再灌注损伤模型的建立方法该实验操作过程均严格遵循有关实验动物保护规定,术前禁食不禁水,大鼠称重后吸入2%-3%七氟醚浅麻醉下,将大鼠固定于试验台,采用文献方法建立大鼠肢体缺血再灌注模型。具体方法：常规消毒后,切开皮肤、皮下,暴露股血管神经束,分离股动脉,动脉夹夹闭股动脉；再用市售橡皮筋(直径2.5cm)环扎大鼠双下肢近心端(压力290-310mmHg,1mmHg=0.133kpa)3h,再灌注0h、2h、4h、8h。S组暴露股动脉后在其下方放一丝线,不阻断血流,LIR组阻断血流。3、大鼠肢体缺血再灌注损伤模型的鉴定实验分为2组,即S组和LIR组。乳酸脱氢酶漏出量可以间接反映小肠组织损伤情况,通过全自动生化分析仪检测血清LDH释放量等方法验LIR的小肠损伤作用。结果发现LIR组大鼠T2及以后各时点血清LDH明显高于对照组(P<0.01)。说明本方法建立的肢体缺血再灌注损伤模型成功。表明缺血再灌注损伤造成小肠细胞损伤,并可影响小肠功能。4.大鼠肢体缺血再灌注损伤诱发小肠细胞自噬相关基因表达的研究(1)大鼠肢体缺血再灌注损伤对小肠细胞Beclinl的mRNA表达的影响收集各组处理后的小肠组织。采用RT-PCR方法定量检测各组小肠细胞Beclinl的nRNA表达量。结果：LIR组小肠组织T2及以后各时点的Beclinl的mRNA相对表达量明显高于S组(P<0.01)。说明缺血再灌注损伤可诱发小肠细胞自噬,造成小肠细胞损伤。(2)大鼠肢体缺血再灌注损伤对小肠细胞Atg5的mRNA表达的影响收集各组处理后的小肠组织。采用RT-PCR方法定量检测各组小肠细胞Atg5的mRNA表达量。结果：LIR组小肠组织T2及以后各时点的Atg5的mRNA相对表达量明显高于S组(P<0.01)。说明缺血再灌注损伤可诱发小肠细胞自噬,造成小肠细胞损伤。(3)大鼠肢体缺血再灌注损伤对小肠细胞LC3的蛋白表达的影响收集各组处理后的小肠组织。采用Western-blot方法定量检测各组小肠细胞LC3的蛋白表达量。结果：LIR组小肠组织T2及以后各时点的LC3II/LC3I的相对表达量明显高于S组(P<0.01)。说明缺血再灌注损伤可诱发小肠细胞自噬,造成小肠细胞损伤。二.长托宁通过抑制细胞自噬减轻小肠缺血再灌注损伤1、实验分组：成年雄性SD大鼠48只,随机分为2组。缺血再灌注组(LIR组),长托宁处理组(PHC组)。LIR组、PHC组组内按再灌注时间分为再灌注Oh(To)、2h(T2)、4h(T4)、8h(T8)4个亚组,每亚组大鼠6只。缺血再灌注组(LIR组)：成年SD大鼠,分离暴露股动脉,动脉夹夹闭股动脉；再用市售橡皮筋(直径2.5cm)环扎大鼠双下肢近心端(压力290-310mmHg,1mmHg=0.133kpa)3h,再灌注Oh、2h、4h、8h。分别于再灌注开放前10min由尾静脉给予相同剂量的生理盐水,于相应时点处死大鼠,取血及小肠组织。长托宁处理组(PHC组)：成年SD大鼠,分离暴露股动脉,动脉夹夹闭股动脉；再用市售橡皮筋(直径2.5cm)环扎大鼠双下肢近心端(压力290-310mmHg,1mmHg=0.133kpa)3h,再灌注0h,2h,4h,8h。分别于再灌注开放前15min由尾静脉给予0.15mg.kg-1的长托宁,于相应时点处死大鼠,取血及小肠组织。2、大鼠肢体缺血再灌注损伤模型的建立方法：同第一部分。3、大鼠肢体缺血再灌注损伤模型的鉴定实验分为2组,LIR组和PHC组。通过全自动生化分析仪检测血清LDH释放量等方法验证肢体缺血再灌注的小肠损伤作用。结果发现PHC组大鼠T2及以后各时点血清LDH明显低于LIR组(P<0.01)。说明本方法建立的肢体缺血再灌注损伤模型成功。也说明长托宁可减轻由缺血再灌注损伤诱导的小肠损伤。4.长托宁对小肠细胞自噬相关基因表达的研究(1)长托宁对小肠细胞Beclinl的mRNA表达的影响收集各组处理后的小肠组织。采用RT-PCR方法定量检测各组小肠细胞Beclinl的mRNA表达量。结果：PHC组小肠组织T2以后时点的Beclinl的mRNA相对表达量明显低于LIR组(P<0.01)。说明长托宁可抑制由缺血再灌注损伤诱导的小肠细胞自噬,减轻小肠组织损伤。(2)长托宁对小肠细胞Atg5的mRNA表达的影响收集各组处理后的小肠组织。采用RT-PCR方法定量检测各组小肠细胞Atg5的mRNA表达量。结果：PHC组小肠组织T2及以后时点的Atg5的mRNA相对表达量明显低于LIR组(P<.01)。说明长托宁可抑制由缺血再灌注损伤诱导的小肠细胞自噬,减轻小肠组织损伤。(3)长托宁对小肠细胞LC3的蛋白表达的影响收集各组处理后的小肠组织。采用Western-blot方法定量检测各组小肠细胞LC3的蛋白表达量。结果：PHC组小肠组织T2以后时点的LC3II/LC3I蛋白相对表达量明显低于LIR组(P<0.01)说明长托宁可抑制由缺血再灌注损伤诱导的小肠细胞自噬,减轻小肠组织损伤。主要结论研究应用成年SD大鼠,成功建立肢体缺血再灌注损伤的模型,以长托宁进行干预,观察长托宁对缺血再灌注小肠细胞自噬及自噬相关基因表达的影响,以阐明长托宁通过抑制自噬减轻小肠细胞缺血再灌注损伤及其机制。主要结论如下：1.本研究应用肢体缺血再灌注损伤的模型在导致小肠组织损伤方面可达到满意效果。2.肢体缺血再灌注损伤可诱发小肠细胞自噬。3.长托宁可抑制由肢体缺血再灌注损伤诱发的小肠细胞自噬。
【作者】康于庆；
【导师】古妙宁；
【作者基本信息】南方医科大学，麻醉学（专业学位），2014，博士
【关键词】小肠；自噬；盐酸戊乙奎醚；肢体缺血再灌注；

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